石蜡切片荧光tunel+IF实验检测凋亡荧光共定位-上海郑核
一、实验器材及试剂
1、实验器材
名称 厂家 型号
脱水机 武汉俊杰电子有限公司 JJ-12J
包埋机 武汉俊杰电子有限公司 JB-P5
病理切片机 上海徕卡仪器有限公司 RM2016
冻台 武汉俊杰电子有限公司 JB-L5
组织摊片机 浙江省金华市科迪仪器设备有限公司 KD-P
烤箱 上海慧泰仪器制造有限公司 DHG-9140A
载玻片 Servicebio
盖玻片 江苏世泰实验器材有限公司 10212432C
脱色摇床 Servicebio TSY-B
涡旋混合器 Servicebio MX-F
掌上离心机 Servicebio D1008E
移液枪 Dragon KE0003087/KA0056573
组化笔 Gene tech GT1001
正置荧光显微镜 日本尼康 Nikon Eclipse C1
成像系统 日本尼康 Nikon DS-U3
2、主要实验试剂
试剂 厂家 货号
无水乙醇 国药集团化学试剂有限公司
二甲苯 国药集团化学试剂有限公司
PBS缓冲液 Servicebio G0002
破膜液 Servicebio G1204
蛋白酶K Servicebio G1205
BSA Servicebio G5001
Tunel试剂盒 Roche 11684817910
一抗
荧光二抗
DAPI Servicebio G1012
抗荧光淬灭封片剂 Servicebio G1401
二、石蜡切片荧光tunel+荧光实验步骤
1、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15-20min-二甲苯Ⅱ15-20min-无水乙醇Ⅰ10min-无水乙醇Ⅱ10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸馏水洗（冬天脱蜡时间稍微延长）。
2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液覆盖组织，37度温箱孵育25min。将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4、加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1 (TdT) 和试剂2(dUTP)按1:9混合，加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温箱孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。
5、BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。
6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）
7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。
8、DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。去除PBS后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
9、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
10、镜检拍照：切片于荧光显微镜下观察并采集图像。（DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm，发绿光；CY3激发波长510-560，发射波长590nm，发红光
三．石蜡切片荧光tunel+IF结果判读
DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，tunel试剂盒为FITC荧光素标记，阳性凋亡细胞为绿光，一抗标记为红色。
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